BCA 法蛋白含量测定试剂盒说明书
(微板法 96 样)
一、产品简介:
BCA 蛋白含量试剂盒提供一种简单,快速,耐去污剂(最多 5%) 的检测蛋白质浓度 的方法。由于蛋白质能将 Cu2+还原成 Cu+;BCA 可与 Cu+结合生成紫蓝色复合物,在 562nm 处有最大光吸光值,颜色的深浅与蛋白含量成正比,因此可根据吸光值测定蛋白质浓度。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 |
规格 |
保存要求 |
备注 |
试剂 A |
液体 25mL×1 瓶 |
4℃保存 |
依据实验用量,临用前试剂 A:B=50:1 的比例混匀成反应 mix |
试剂 B |
液体 0.5mL×1 支 |
4℃保存 |
|
标准品 |
液体 1.5mL×1 支 |
4℃保存 |
若重新做标曲,则用到该试剂 |
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、台式离心机、恒温水浴锅、移液器和蒸馏水。
四、蛋白含量测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费!
1、样本制备:
(1)组织样本:
称取约 0. 1g 组织,加入 1mL 提取液(提取液可选用酶提取缓冲液、蒸馏水、生理盐水) 冰浴匀浆,12000rpm ,4℃离心 10min ,取上清,即待测液。
【注】: 依据研究经验,一般需将样本粗提液稀释到适当倍数再进行测定,如 10 倍。实 验前可以先选 2 个样本测定,摸索确定适合本次实验的稀释倍数。
(2)细菌或细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清; 取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液; 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W ,超声 3s ,间隔 10s ,重复 30 次), 12000rpm ,4℃离心 10min ,取上清,即待测液。
【注】: 依据研究经验,一般需将样本粗提液稀释到适当倍数再进行测定,如 10 倍。实
验前可以先选 2 个样本测定,摸索确定适合本次实验的稀释倍数。
(3)液体样本: 澄清无色液体样品可以直接测定。若浑浊,离心后取上清检测。
2 、上机检测
(1)酶标仪预热 30min ,调节波长到 562 nm。
(2)反应 mix 置于 60℃水浴预热 30 min (仅煮一次即可)。
试剂名称(μL) |
测定管 |
空白管(只做一次) |
样本 |
5 |
|
蒸馏水 |
|
5 |
反应 mix |
200 |
200 |
混匀,于 60℃保温 30min ,全部转移到 96 孔板, 于 562nm 处测定吸光值 A ,△A= A 测定-A 空白。 |
【注】: 若△A ﹥ 1.5 ,需将样本用提取液稀释后再测定。
本试剂盒仅供科研使用
五、结果计算:
1 、标准曲线方程: y = 0. 188x - 0.0046;x 是标准品质量(μg),y 是△A。
2、Cpr (mg/g 鲜重)= [(△A+0.0046)÷0. 188×10-3]÷(V1÷V×W) ×D =1.06×(△A+0.0046) ÷W×D
3 、Cpr (mg/mL)=[ (△A+0.0046)÷0. 188×10-3]÷V1×D=1.06×(△A+0.0046)×D
4 、Cpr (μg/104 cell))=[ (△A+0.0006)÷0.0687]÷(V1÷V×500)×D=2. 13×(△A+0.0006)×D
V----提取液体积: 1mL;
V1----加入粗提液体积: 0.005mL;
W----样本质量: g;
D----稀释倍数;
500---细菌或细胞总数,500 万。
附: 标准曲线制作过程:
1 标准品母液(500μg/mL)。
2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品: 0, 100, 200, 300, 400, 500. μg/mL。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。
3 依据测定管加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。